Приказ 26 ноября 1998 г. N 342 об усилении мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и




НазваниеПриказ 26 ноября 1998 г. N 342 об усилении мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и
страница6/11
Дата конвертации25.04.2013
Размер1.23 Mb.
ТипДокументы
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

гамма-глобулин в рабочем разведении (это разведение указано на

этикетке каждой ампулы); мазки вновь выдерживают во влажной камере

30 минут при +37ёС. В качестве антивидовых препаратов применяют

люминесцирующие сыворотки против гамма-глобулина человека и

животных в зависимости от видовой принадлежности испытуемых

сывороток. На этом этапе выполнения реакции также рекомендуется

использование бычьего альбумина, меченого родамином, или 0,1%

раствора Эванса для гашения неспецифического свечения, которые

смешиваются с антивидовой люминесцирующей сывороткой в равном

объеме, с тем, чтобы иметь рабочие дозы указанных ингредиентов.

Далее препараты промывают в двух порциях буфера в течение 10 минут

и высушивают на воздухе.

В качестве контроля в каждый опыт вводят заведомо

положительную и отрицательную сыворотки и контроль люминесцирующей

антивидовой сыворотки: антиген обрабатывают непосредственно

антивидовой люминесцирующей сывороткой.

Титром сыворотки считают то наибольшее ее разведение, которое

обусловливает свечение риккетсий на \"++\", при наличии свечения на

\"+++\" или \"++++\" в предыдущем разведении.

Контроль флуоресцирующей антивидовой сыворотки - свечение

риккетсий отсутствует при обработке антигена флуоресцирующей

антивидовой сывороткой в рабочем разведении.

2.3. Реакция связывания комплемента.

Реакция связывания комплемента (РСК) является универсальной,

так как дает возможность получения объективных результатов при

проведении текущей и ретроспективной диагностики. Комплемент

связывающие антитела сохраняются в сыворотке переболевших людей

десятки лет. В этой связи РСК незаменима для ретроспективной

диагностики.

РСК имеет целью определение в исследуемых сыворотках

специфических антител.

Сущность реакции заключается в связывании комплемента

комплексом антиген-антитело, что обнаруживается в присутствии

индикатора: бараньих эритроцитов, сенсибилизированных

гемолитической сывороткой. При образовании специфического

комплекса антиген-антитело последний связывает комплемент,

вследствие чего после добавки гемолитической системы не возникает

гемолиза бараньих эритроцитов. Если же комплекс антиген-антитело

не образуется, свободный комплемент вызывает гемолиз

сенсибилизированных эритроцитов.

Таким образом, положительный результат РСК характеризуется

оседанием эритроцитов (задержкой гемолиза), а отрицательный -

феноменом гемолиза эритроцитов.

Ниже приведены две схемы постановки РСК, отличающиеся рядом

преимуществ в сравнении с ранее применявшимися в нашей стране

(Голиневич, 1962):

1) уменьшением объема использованных ингредиентов;

2) упрощением схемы титрования комплемента;

3) получением более достоверных результатов реакции за счет

титрования комплемента в присутствии антигенов (риккетсиальные

антигены могут поглощать некоторое количество комплемента, что

следует принимать во внимание и учитывать при постановке реакции).

Ингредиенты реакции: 1) испытуемая сыворотка, 2) антиген;

3) комплемент, 4) гемолитическая сыворотка, 5) эритроциты барана.

Обязательным условием постановки РСК является использование

точно оттитрованных компонентов. Реакцию ставят в объеме 0,5 мл

(1-я схема) или 0,6 мл (2-я схема).

Для обеспечения точности получаемых результатов необходимо

пользоваться отдельной посудой (пробирки, пипетки, колбы), хорошо

вымытой и высушенной в суховоздушном шкафу.

Для каждого ингредиента реакции используют отдельную пипетку.

Все разведения делают в свежеприготовленном стерильном

физиологическом растворе (0,85% раствор химически чистого хлорида

натрия в дистиллированной воде).

Исследуемую сыворотку прогревают перед опытом в течение 30

минут при 56-58ёС (для разрушения содержащимися в ней комплемента

и ингибиторов).

Риккетсиальные антигены растворяют в указанном на этикетке

ампулы количестве физиологического раствора, которое соответствует

рабочему разведению, определенному предприятием-изготовителем.

Сухой комплемент разводят согласно прилагаемой к этому

препарату инструкции. Гемолитическая сыворотка выпускается в

ампулах: это - сыворотка кролика, иммунизированного по

определенной схеме взвесью бараньих эритроцитов. На этикетке

ампулы гемолитической сыворотки указан ее титр. В реакции

используют разведение гемолитической сыворотки в три раза меньше

титра, указанного на этикетке: например, титр, указанный на

этикетке, равен 1:1800; в этом случае в опыт берут сыворотку,

разведенную 1:600. При длительном хранении первоначальный титр

гемолитической сыворотки может снижаться. Проверку ее титра

производят следующим образом. Готовят основное разведение

сыворотки 1:100 (0,1 мл гемолитической сыворотки +9,9 мл

физиологического раствора). В ряд пробирок последовательно

разливают по 0,1 мл разведений гемолитической сыворотки, начиная с

1:1000 до 1:3600, в каждую пробирку добавляют комплемент в

разведении 1:10 в объеме 0,1 мл и по 0,1 мл 3% взвеси бараньих

эритроцитов; затем доливают в каждую пробирку по 0,2 мл

физиологического раствора. Смесь ингредиентов выдерживают в

термостате при +30ёС в течение 1 часа. По наличию полного гемолиза

эритроцитов судят о титре сыворотки. Схема титрования

гемолитической сыворотки представлена в таблице 1.

Таблица 1

СХЕМА ТИТРОВАНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ

+----------------------------------------------------------------------------------------+

| Ингредиенты | Разведение гемолитической сыворотки |

| опыта |---------------------------------------------------------------------|

| |1:1000|1:1200|1:1600|1:1800|1:2000|1:2400|1:2800|1:3000|1:3200|1:3600|

|------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------|

|Гемолитическая сы-| 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |

|воротка (мл) | | | | | | | | | | |

|------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------|

|3% взвесь бараньих| 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |

|эритроцитов (мл) | | | | | | | | | | |

|------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------|

|Комплемент в раз-| 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |

|ведении (мл) | | | | | | | | | | |

|------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------|

|Физ. раствор (мл) | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |

|------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------|

|Оценка результатов| - | - | - | - | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |

|опыта | | | | | | | | | | |

+----------------------------------------------------------------------------------------+

Титр гемолитической сыворотки 1:1800.

Для получения эритроцитов барана кровь, взятую из яремной

вены животного, дефибринируют во флаконе со стеклянными круглыми

бусами путем встряхивания в течение 10-15 минут, процеживают через

стерильную марлю и хранят в холодильнике при температуре от 0 до

+4ёС. Перед опытом дефибринированную кровь многократно отмывают

при центрифугировании физиологическим раствором (до исчезновения

следов гемолиза) и готовят взвесь эритроцитов. Эритроциты хранят

обычно в течение 1 месяца в консерванте \"Консервант крови N 7Б\",

выпускаемом Пензенским заводом медицинских препаратов, или

каком-либо другом консерванте.

1-я схема постановки РСК.

Титрование комплемента. Постановке основного опыта РСК

предшествует титрование комплемента с целью определения его

рабочей дозы. Титрование комплемента ведут в присутствии антигена.

Из основного разведения комплемента 1:10 готовят различные дозы в

1 мл (таблица 2).

Таблица 2

+----------------------------------------------------------------+

| Ингредиенты | Дозы комплемента |

| реакции |-----------------------------------|

| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |

|----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---|

|Комплемент в разведении 1:10|0,1|0,2|0,3|0,4|0,5|0,6|0,7|0,8|0,9|

|(мл) | | | | | | | | | |

|----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---|

|Физиологический раствор (мл)|0,9|0,8|0,7|0,6|0,5|0,4|0,3|0,2|0,1|

+----------------------------------------------------------------+

Затем ставят опыт титрования комплемента.

Таблица 3

+----------------------------------------------------------------+

| Ингредиенты | Дозы комплемента |

| реакции |-----------------------------------|

| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |

|----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---|

|Комплемент в различных дозах|0,1|0,1|0,1|0,1|0,1|0,1|0,1|0,1|0,1|

|(мл) | | | | | | | | | |

|----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---|

|Антиген (мл) |0,1|0,1|0,1|0,1|0,1|0,1|0,1|0,1|0,1|

|----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---|

|Физиологический раствор (мл)|0,1|0,1|0,1|0,1|0,1|0,1|0,1|0,1|0,1|

|----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---|

|Гемолитическая система (мл) |0,2|0,2|0,2|0,2|0,2|0,2|0,2|0,2|0,2|

|----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---|

|Оценка результатов |4+ |3+ |2+ | + | - | - | - | - | - |

+----------------------------------------------------------------+

Оттитрованный комплемент ставят в термостат при +37ёС на 1

час. Через час добавляют гемолитическую систему, состоящую из

равных объемов 3% взвеси эритроцитов барана в физиологическом

растворе и гемолитической сыворотки в тройном титре (выдержанную

предварительно в термостате в течение 30 минут) и через 30 минут

производят учет результатов.

Оценка результатов титрования комплемента заключается в

определении степени задержки гемолиза: отсутствие гемолиза (полная

его задержка) обозначается четырьмя крестами (++++); почти полная

задержка (следы гемолиза) обозначается тремя крестами (+++);

частичная задержка гемолиза оценивается двумя крестами (++) и,

наконец, следы задержки (почти полный гемолиз) - одним крестом

(+).

Единицей комплемента считают то наименьшее ее количество,

которое вызывает полный гемолиз эритроцитов. В приведенном примере

эта единица соответствует 5-й дозе. За полную единицу комплемента

принимают вторую пробирку полного гемолиза, в данном примере - 6-я

доза. Рабочая доза комплемента равна одной полной единице

комплемента при проведении связывания в термостате при +37ёС в

течение 1 часа.

Постановка основного опыта.

1 этап. Инактивированные испытуемые сыворотки разводят обычно

двукратно в пределах 1:10 - 1:640 и выше в зависимости от срока

болезни физиологическим раствором и разливают по 0,1 мл. К

различным разведениям их добавляют по 0,1 м: антигена и

комплемента в рабочих дозах.

К каждому опыту ставят следующие контроли:

1) контроль всех испытуемых сывороток (0,1 мл сыворотки в

исходном разведении + 0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл

комплемента в рабочей дозе);

2) контроль антигена (0,1 мл антигена + 0,1 мл

физиологического раствора, 0,1 мл комплемента в рабочей дозе);

3) контроль комплемента (0,1 мл комплемента в рабочей дозе +

0,2 мл физиологического раствора);

4) контроль гемолитической системы (0,3 мл физиологического

раствора);

5) контроль заведомо положительной сыворотки, которую титруют

до ее титра;

6) контроль заведомо отрицательной сыворотки, которую титруют

в 2-х-3-х разведениях (1:10 - 1:40), включая так, же как и для п.

5 контроли сывороток в исходных разведениях.

После добавления всех указанных ингредиентов и тщательного

встряхивания пробирки ставят в термостат при +37ёС на 1 час.

2 этап. Вынимают пробирки из термостата и добавляют в каждую

по 0,2 мл гемолитической системы (предварительно выдержанной в

термостате 30 минут). Опять тщательно встряхивают и ставят

пробирки в термостат на 20-30 минут в зависимости от гемолиза

эритроцитов в контролях.

2-я схема постановки РСК (по Fiset).

Указанная схема отличается от первой общим объемом реакции -

0,6 мл, упрощенным титрованием комплемента, которое проводится при

температуре +4ёС 16-18 часов не в день постановки реакции, 1-2

раза на протяжении месяца при условии работы с одной серией

эритроцитов и комплемента: сухого или нативного, взятого у морских

свинок и хранящегося при температуре не выше +-20ёС (однако

размороженный комплемент повторному замораживанию не подлежит).

Титрование комплемента.

Готовят основное разведение комплемента 1:10 (в случае наличия

сухого комплемента содержимое ампулы растворяют в 10 мл

физиологического раствора), из которого по схеме получают

последующие его разведения (обычно до 1:30 - 1:40) (таблица 4).

Таблица 4

+----------------------------------------------------------------+

| Ингредиенты | Разведения комплемента |

| |-----------------------------------|

| |1:15 |1:18 |1:20 |1:25 |1:30|и т.д.|

|----------------------------+-----+-----+-----+-----+----+------|

|Комплемент 1:10 (мл) | 1 | 1 | 0,5 | 0,5 |0,5 | |

|----------------------------+-----+-----+-----+-----+----+------|

|Физиологический раствор (мл)| 0,5 | 0,8 | 0,5 | 0,75|1,0 | |

+----------------------------------------------------------------+

Из приготовленных разведений комплемента переносят по 0,1 мл

его в контрольный ряд (без антигена) и опытные ряды (по числу

использованных в РСК антигенов) (таблица 5).

Таблица 5

+----------------------------------------------------------------+

| Ингредиенты реакции | Разведение комплемента |

|----------------------------------------------------------------|

| Контрольный ряд (оценка качества комплемента) |

|----------------------------------------------------------------|

| |1:10|1:15|1:18|1:20|1:25|1:30|и т.д.|
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

Похожие:

Приказ 26 ноября 1998 г. N 342 об усилении мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и iconПриказ Минздрава РФ от 26 ноября 1998 г. N 342 "Об усилении мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и борьбе с педикулезом"
В связи с высоким уровнем пораженности населения педикулезом, в том числе платяным, в Российской Федерации сохраняются реальные предпосылки...
Приказ 26 ноября 1998 г. N 342 об усилении мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и iconКалендарный план основных мероприятий мэрии города Ярославля с 26 ноября по 02 декабря 2012 года 26 ноября, понедельник
«Энергия жизни» программа по профилактике употребления энергетических напитков
Приказ 26 ноября 1998 г. N 342 об усилении мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и iconПриказ Минфина РФ от 25 ноября 1998 г. N 56н "Об утверждении Положения по бухгалтерскому учету "События после отчетной даты" (пбу 7/98)"
Правительства Российской Федерации от 6 марта 1998 г. N 283, и во исполнение распоряжения Правительства Российской Федерации от 22...
Приказ 26 ноября 1998 г. N 342 об усилении мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и iconПриказ от 26 ноября 1997 г. N 345 о совершенствовании мероприятий по профилактике внутрибольничных инфекций в акушерских
Федеральной целевой программы "Безопасное материнство", утвержденной Постановлением Правительства Российской Федерации от 14. 10....
Приказ 26 ноября 1998 г. N 342 об усилении мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и iconПриказ от 31 июля 2009 г. N 547 о совершенствовании мероприятий по профилактике острых респираторных заболеваний и готовности к
Согласно информации Всемирной организации здравоохранения (воз) среди людей начиная с
Приказ 26 ноября 1998 г. N 342 об усилении мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и iconПриказ от 29 апреля 1998 г. N 142 о перечне видов медицинской деятельности, подлежащих лицензированию Зарегистрировано в Минюсте РФ 25 мая 1998 г. N 1525
Бюллетень нормативных актов федеральных органов исполнительной власти, n 12, 1998
Приказ 26 ноября 1998 г. N 342 об усилении мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и iconПеречень распоряжений губернатора санкт-петербурга, принятых с 1 ноября 1998 Г. По 30 ноября 1998 Г
О подготовке к участию делегации Санкт-Петербурга в выставке "Инвестиции в недвижимость "mipim-99"
Приказ 26 ноября 1998 г. N 342 об усилении мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и iconНаграды и поощрения: Школьные благодарности
...
Приказ 26 ноября 1998 г. N 342 об усилении мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и iconАлтайского края п о с т а н о вление
Об усилении противопожарной защиты города и осуществлении противопожарных мероприятий в осеннее-зимний период 2006-2007гг
Приказ 26 ноября 1998 г. N 342 об усилении мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и iconПриказ Минздрава РФ от 7 октября 1997 г. N 297 "О совершенствовании мероприятий по профилактике заболевания людей бешенством"
В связи с обострением в последние годы на территории Российской Федерации эпизоотологической обстановки по бешенству значительно...
Разместите кнопку на своём сайте:
Библиотека


База данных защищена авторским правом ©tnu.podelise.ru 2013
обратиться к администрации
Библиотека
Главная страница