Методические указания Методические указания разработаны фгун «цнии эпидемиологии»




НазваниеМетодические указания Методические указания разработаны фгун «цнии эпидемиологии»
страница3/5
Дата конвертации19.11.2013
Размер0.63 Mb.
ТипМетодические указания
1   2   3   4   5

7. Показания к исследованию


Исследование на сальмонеллез проводят с целью диагностики заболеваний, выявления сальмонеллоносительства, определения соответствия гигиеническим требованиям безопасности пищевых продуктов, выявления обсемененности объектов внешней среды, а также при расследовании вспышек сальмонеллезов с целью установления источников и факторов передачи возбудителей инфекции.

8. Исследование клинического материала



8.1. Взятие и транспортировка

8.1.1. Для исследования на наличие сальмонелл отбирают испражнения, рвотные массы и промывные воды желудка, кровь, мочу, а при наличии специальных показаний - желчь, дуоденальное содержимое, спинномозговую жидкость и секционный материал.

8.1.2. Патологический материал следует доставлять в лабораторию в возможно короткий срок, но не позднее 12 ч. после отбора, испражне­ния (фекалии) - не позднее 3-4 ч.; кровь высевают у постели больного.

В случае невозможности доставки в установленные сроки мате­риал посылают в консерванте или в транспортной среде. Такой материал до исследования хранят при 4-6оС не более 24 ч.

При отборе проб необходимо исключить возможность контамина­ции их за счет смежных областей кожи, других органов, внешней среды и т. п.

8.1.3. Испражнения собирают сразу после дефекации с помощью стерильной стеклянной палочки или деревянного шпателя. При наличии патологических примесей (слизь, кровь, гной и т. п.) их включают в отбираемую пробу. В случае невозможности получения испражнений после дефекации материал берут непосредственно из прямой кишки с помощью «зонд тампона», вводя его в кишку на 8-10 см. Тампон помещают в пробирку с консервантом.

8.1.4. При профилактических обследованиях здоровых лиц на сальмонеллоносительство накануне взятия испражнений для исследования можно применить солевое слабительное (25-30 г магнезии сульфата - MgSO4), растворенное в теплой воде. Не принимается для исследова­ния на сальмонеллоносительство материал, взятый на дому в от­сутствии медицинского работника.

8.1.5. Кровь для исследования берут в начале заболевания, а также повторно в период лихорадки или в разгар рецидивов стерильным шприцем из локтевой вены в объеме 2-10 мл (в зависимости от возрас­та пациента); в более поздние сроки или при слабовыраженной клинической картине - 15-20 мл. Взятую кровь высевают у постели больного.

У детей до одного года кровь берут в доступных количествах из пальца, пятки или мочки уха.

8.1.6. Рвотные массы и промывные воды желудка отбирают при заболевании, сопровождающемся соответствующей симптоматикой, в объеме до 100 мл. Для исследования используют первые порции промывных вод, полученные без применения бактерицидных средств.

В случае кислой реакции (рН<4,5) рвотных масс их перед посевом нейтра­лизуют 10%-ным раствором бикарбоната натрия, промывные воды центрифугируют 15 мин. при 3000 об/мин. и в дальнейшем используют осадок. В случае невозможности центрифугирования допускается высев нативного материала.

8.1.7. Желчь (дуоденальное содержимое) собирают в стерильные пробирки. При этом отдельно собирают дуоденальное содержимое, пузырную желчь и желчь из желчных протоков (порции А, В и С соот­ветственно).

Кислая реакция, белесоватый оттенок, наличие хлопьев свиде­тельствуют о примеси желудочного сока и делают материал непригод­ным для бактериологического исследования.

8.1.8. Мочу для исследования собирают после тщательного туалета. Первую порцию мочи не берут для анализа, остальную в количестве 20-30 мл собирают в стерильную посуду и доставляют в лабораторию. Мочу центрифугируют 15 мин. при 3000 об/мин. Для исследования используют осадок. Допускается высев нативного материала.

8.1.9. Спинномозговая жидкость подлежит исследованию при наличии менингеального или менингоэнцефалитического синдромов.

Пробу (3-5 мл) помещают в стерильную пробирку и доставляют в лабораторию, предохраняя материал от замораживания (можно ис­пользовать термос).

8.1.10. Операционный и секционный материал для исследования отбирают в случае необходимости при оперативных вмешательствах или на месте вскрытия. Масса пробы должна быть не менее 20 г.

В сопроводительном документе необходимо указать, какое учреж­дение направляет материал, фамилию, имя, отчество и возраст обсле­дуемого, место работы (для детей - название детского учреждения или школы), дату заболевания, предполагаемый диагноз или показа­ния к обследованию, дату и час взятия пробы материала, фамилию и должность лица, посылающего материал.

8.2. Подготовка к исследованию клинического материала

8.2.1. Доставленные в лабораторию образцы клинического материала подготавливают к посеву в среды обогащения и на дифференциально-диагностические среды

8.2.2.Операционный и секционный материал массой не менее 20 г растирают в ступках;

8.2.3. Рвотные массы, промывные воды желудка и мочу центрифугируют. При кислой реакции (рН<4,5) рвотные массы перед центрифугированием нейтрализуют 10% раствором питьевой соды (рН 7,0-7,4).

8.3. Методы выделения

Эффективность проводимого исследования, направленного на выделение сальмонелл из разных материалов, в первую очередь зависит от применения соответствующих сред обогащения и адекватных дифференциально-диагностических сред.

В настоящее время освоен коммерческий выпуск большинства питательных сред рядом производителей, имеющих регистрационные удостоверения и сертификаты производства. В тех случаях, когда рекомендуемые среды отсутствуют, их готовят в лабораторных условиях в соответствии с ГОСТ Р 52814-2007 или МУ по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями, 1984 г. Контроль питательных сред осуществляют в соответствии с МУК 4.2.2316-08.

Рекомендуемые среды обогащения делятся на неселективные первичные (забуференная пептонная вода) и среды селективного обогащения (магниевая, селенитовая, Мюллер-Кауфмана, Раппапорт-Вассилиадис, селенит-цистиновая).

Дифференциально-диагностические среды в свою очередь делятся на слабо селективные и высоко селективные. К первым относятся Эндо агар, Мак-Конки агар, бриллиант-грюн агар. Ко вторым – Плоскирева агар, SS-агар, ксилозо-лизин деоксихолат агар, висмут-сульфит агар.

Характер роста сальмонелл на указанных средах приведен в табл. 1

Характер роста сальмонелл на различных

дифференциально-диагностических средах

Табл. 1

Название среды

Вид колоний сальмонелл

1. Бриллиант-грюн агар

Розовые

2. Мак-Конки агар

Бесцветные

3.Ксилозо-лизин- деоксихолат агар)

Черные с бесцветным ободком за исключением S.Typhi, которые растут в виде светлых колоний

4. Сальмонелла шигелла агар (SS)

С черным центром

5. Висмут сульфит агар

Черные, среда под колонией прокрашивается. Некоторые серовары сальмонелл (S.Para A, S.Gallinarum могут быть слегка зеленоватыми)

6. агар Эндо

Бесцветные, слегка розовые

7. Агар Плоскирева

Бесцветные, слегка розовые, иногда с черным центром


8.3.1.После подготовки материала от больных к исследованию производят его посев на среду обогащения. При этом можно использовать как среды отечественного производства, так и импортные, разрешенные к реализации в России. При необходимости допускается приготовление некоторых сред в лабораторных условиях (магниевая среда, селенитовая среда, Мюллер-Кауфман среда, среда Раппапорт-Вассилиадис).

Непосредственный высев материала из среды обогащения до ее инкубирования в термостате может заменить прямой высев на дифференциально-диагностические среды.

8.3.2. Испражнения, доставленные в фосфатно-буферном растворе, высевают в среду обогащения двойной концентрации в соотношении 1:1. Фекалии, доставленные в глицериновом консерванте или транспортной среде, помещают в обычную среду обогащения в соотношении 1:10. Испражнения, достав­ленные без консерванта, суспендируют в среде обогащения в соотношении 1:5. Из указанных суспензий делают высев на дифференциально-диагности­ческие среды, оставшуюся часть инкубируют в термостате.

8.3.3. Кровь, взятую из вены, высевают в двойную среду. В случае крайней необходимости в 10-20%-ный желчный бульон. После 16-20 ч. инкубирования делают высев на одну из дифференциально-диагностических сред. При отрицательном результате делают повторные посевы на 3-и, 5-е, 8-e сутки.

8.3.4.Рвотные массы, промывные воды желудка и мочу после центрифугирования высевают в среды обогащения. В случае исследо­вания материала без центрифугирования посев проводят в среду обогащения двойной концентрации в соотношении 1:1 и после 18-24 ч. инкубирования делают высев на дифференциально-диагностические среды.

8.3.5.Каждую фракцию желчи (дуоденального содержимого) высевают во флаконы со слабощелочным питательным бульоном в соотношении 1:10 и на дифференциально-диагностические среды. Через 18-24 ч. из флаконов осуществляют повторный высев на дифференциально-диагностические среды. В случае получения отрицательных результатов высев повторяют на 3 и, 5-, 7-е сутки, используя среды слабой селективности.

8.3.6.Спинномоз­говую жидкость высевают на шоколадный агар.

8.3.7.Операционный и секционный материал высевают в одну из сред обогащения в отношении 1:10. Допускается одновременный высев суспензии материала в среду обогащения и на дифференциально-диагностические среды.

8.3.8.При наличии другого клинического материала его высевают на две-три дифференциально-диагностические среды (комбинируя высоко- и низко селективные среды и в емкости со средой обогащения одновременно).

При посеве на плотные среды исследуемый материал наносят с помощью бак­териологической петли (материал от больных), пипетки, стеклянной палочки или тампона (пробы продуктов и смывы) с последующим втиранием материала шпателем по всей по­верхности среды. На высоко селективные среды посевной материал вносят в большом объеме (в 3-5 раз), чем на слабо селективные.

Пластинчатые среды подсушивают, на их поверхности не должна оставаться конденсационная жидкость, что обеспечивает рост изолированных колоний.

8.3.9. После инкубирования посевов на средах обогащения делается повторный высев на дифференциально-диагностические среды с последующим отбором подозрительных колоний (приложение 2.5.)

Необходимо учитывать, что при исследовании различных материалов на инфицированность сальмонеллами отличаются только начальные этапы анализа (правила взятия материала, его обработка, выбор адекватных питательных сред). Начиная с отбора колоний на дифференциально-диагностических средах, последующие этапы бактериологического исследования идентичны.

9. Исследование пищевых продуктов

9.1. Взятие проб и их транспортировка.

9.1.1. Объектами исследования могут являться продукты, указанные в СанПиН 2.3.2.1078-01, а также остатки пищи, употреб­ленной заболевшими, а также исходные продукты и полуфабрикаты, которые использовали при ее приготовлении, суточные пробы готовой пищи и др. подозреваемые в качестве фактора передачи возбудителя инфекции.

9.1.2. Пробы для исследования отбирают по ГОСТ 26668-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологического анализа, по ГОСТ 9792-73, «Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб», а также «Мясо птицы» (ГОСТ №7702.20-95). «Субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб».

9.1.3.Остатки консервов направляют в лабораторию непосред­ственно в той банке, из которой их использовали в пищу. При от­сутствии остатков консервов исследованию подлежит содержимое 2-5 невскрытых банок с аналогичной маркировкой.

9.1.4. Мелкую рыбу отбирают в количестве 2-3 шт., у крупной вырезают 3-4 куска из спинки, ближе к голове, и из участков около анального отверстия общей массой не менее 200 г.

9.1.5. Солонину и соленые продукты, находящиеся в бочечной таре, берут сверху, из середины и со дна бочки. Общая масса пробы должна быть не менее 200 г. В отдельную посуду набирают 100-200 мл рассола.

9.1.6. Пробы жидких и полужидких продуктов и кормов (супы, соусы, заменитель цельного молока - ЗЦМ) отбирают после тщатель­ного перемешивания в количестве около 200 г.

9.1.7. Молочные продукты заводского приготовления доставляют в лабораторию в оригинальной упаковке, прочие - в объеме до 200 мл.

9.1.8. Суточные пробы направляют для исследования непос­редственно в той посуде, в которой они хранились в холодильнике. Остатки фактически употребленной пищи отбирают в той посуде, в которой их обнаружили.

9.1.9. Яйца отбирают по 5 шт. из шести разных мест обследуемой партии; в первую очередь берут яйца, хранившиеся более 7 дней.

9.1.10. Материал, подлежащий исследованию, помещают в стерильную посуду (банки, пробирки, флаконы), новые полиэтиленовые пакеты, стерильную пергаментную бумагу, тщательно укупоривают и упако­вывают.

Пробы можно брать в стерильные одноразовые емкости, стаканы или банки, прокипяченные 15 мин. Обработка посуды дезинфицирующими средствами не допускается.

Каждую пробу снабжают этикеткой с наименованием материала и источника его получения.

При направлении проб продуктов дополнительно указывают, какой из продуктов подозревается в качестве фактора риска.

9.2. Подготовка к исследованию

9.2.1.При исследовании пищевых продуктов делают навеску. Величина навески определяется видом продукта, масса которого должна соответствовать величине норматива на отсутствие в нем бактерий рода сальмонелла. Чаще всего масса навески составляет 25 г.

9.2.2. Продукты плотной консистенции гомогенизируют или растирают в ступках.

9.2.3. Пищевые продукты, бактериологическое исследование которых проводят в соответствии с требованиями МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов» и ГОСТ 30705-2000 «Продукты молочные для детского питания. Методы микробиологического анализа», берут для исследо­вания в количестве, предусмотренном в указанных документах.

9.2.4. Крем, сливочное масло, мороженое и т. п. перед посевом расплав­ляют в водяной бане.

9.2.5. Жидкие продукты, имеющие кислую реакцию (рН меньше 4,5), перед посевом нейтрализуют 10%-ным стерильным раствором бикарбоната натрия до слабощелочной реакции (рН 7,0-7,4).

9.2.6. При исследовании яиц скорлупу обрабатывают спиртом и обжи­гают, после чего яйца разбивают и отделяют желток и белок в стерильную посуду, объединяя отдельно по пять желтков и белков в одной пробе. Желтки и белки гомогенизи­руют и используют для посева.

9.3. Методы выделения

9.3.1.Подготовленные пробы продуктов питания высевают в неселективную среду обогащения в соотношении 1:10.

Одновременно делают посев материала из указанной среды до ее инкубирования на дифференциально-диагностические среды. Предпочтительно использовать одну чашку с низко селективной средой и одну с высоко селективной. Инкубируют посевы при 37оС в течение 18-24 часов (чашки с висмут-сульфит агаром – 48 часов).

После инкубирования посевов на неселективной среде обогащения проводится посев материала в две среды селективного обогащения. При этом должно соблюдаться следующее соотношение посевной дозы и объема среды обогащения. Для всех указанных сред обогащения оно составляет 1 мл надосадочной жидкости на 10 мл среды и инкубировании 18-20 час при 37оС. Для среды Мюллер-Кауфмана 1 мл надосадочной жидкости на 10 мл среды инкубирование 18-20 час. при 41,5-42оС (приложение 3,4).

При использовании среды Раппапорт-Василиадис вносить 0,1 мл из неселективной среды обогащения (забуференной пептонной воды) в 10 мл указанной среды и инкубировать при 42оС в течение 18-24 час.

Материал, прошедший инкубацию на средах селективного обогащения, высевается на чашки Петри с двумя-тремя дифференциально-диагностическими средами (приложение 2,5).


10. Исследование объектов окружающей среды

Основными объектами окружающей среды, подлежащими исследованию на наличие сальмонелл, являются смывы с различных предметов на эпидемиологически значимых объектах и в лечебно-профилактических учреждениях, а также вода (питьевая, открытых водоисточников, сточная), воздух и почва.

10.1. Взятие проб и их транспортировка

10.1.1. Отбор проб смывов осуществляют стерильными ватными или ватно-марлевыми тампонами. Тампоны монтируют на деревянной палочке или проволоке, пропущенной через пробку, помещают в пробирку и стерилизуют 30 мин. при температуре 120оС. Затем в каж­дую пробирку наливают 2 мл предварительной среды обогащения - забуференной пептонной воды рН 7,0. Непосредственно перед взятием смыва тампон увлажняют, наклоняя пробирку, изли­шек влаги отжимают о стенку пробирки.

Смывы берут с площади не менее 100 см2, если нет специальных указаний для данного объекта.

При взятии смывов с яичной скорлупы один тампон используют для исследования 10 яиц.

10.1.2. Для отбора проб воды используют стерильные флаконы вместимостью 0,5 л с притертой, каучуковой или корковой пробкой.

Пробы воды (питьевой) отбирают при соблюдении правил стерильности, после предварительной стерилизации кранов обжиганием пламенем горящего тампона, смоченного спиртом, и последующего спуска воды в течение 10-15 мин. при полностью открытом кране. Пробы должны быть исследованы не позже чем через 2 ч. после их отбора.

При невозможности выполнения этих условий анализ допускается проводить не позже чем через 6 ч. после отбора проб, сохраняя их при температуре 4 ±20С.

Пробы воды открытых водоемов или сточных вод отбирают в соответствии с МУК 4.2.1884-04.

10.1.3. Анализ почвы на наличие сальмонелл проводят по эпидпоказаниям. Навеску в 50 г помещают в среду неселективного обогащения в соотношении 1:10 и дальнейшее исследование выполняют аналогично пищевым продуктам.

10.1.4. Отбор проб воздуха

Определение наличия сальмонелл в воздухе проводится по эпидпоказаниям.

Пробы воздуха отбирают аспирационным методом с помощью аппаратов и устройств, разрешенных к применению в установленном порядке.

Количество пропущенного воздуха должно составлять 250 дм3 на одну чашку с дифференциально-диагностической средой. В качестве таких сред используют 2 чашки с агаром эндо и две чашки с висмут-сульфит агаром. Таким образом, объем пропущенного через аппарат воздуха составляет 1000 дм3.

10.2. Подготовка к исследованию

10.2.1. Подготовка к исследованию воды необходима при использовании метода мембранной фильтрации при определении наличия в ней сальмонелл. Для этого берутся 2 объема воды по 500 мл каждый. Каждый объем фильтруют через один или несколько мембранных фильтров.

10.3. Методы выделения

10.3.1. При исследовании смывов после высева на среду Кесслера смывную жидкость заливают 5 мл одной из рекомендуемых для выделения сальмонелл сред обогащения (магниевая, селенитовая или среда Раппапорт-Вассилиадис) и помещают в термостат при 37оС на 18-20 ч. После инкубации делают высев на среду Эндо и висмут сульфит агар с последующим отбором подозрительных колоний и их идентификацией.

10.3.2. При исследовании воды питьевой, поверхностных водных объектов и сточных вод берутся 2 пробы по 500 мл каждая и вносятся в равный объем селективной среды обогащения двойной концентрации. При использовании мембранной фильтрации для исследования полученные фильтры помещают в 50 мл в каждой из двух сред накопления, например магниевую и селенитовую, или среду Раппапорт-Василиадис и селенитовую.

Посевы инкубируют при 37оС 18-20 ч. Затем делают высев на дифференциально-диагностические среды. Дальнейший анализ ведут также как и при выделении сальмонелл из других объектов исследования.

10.3.3. При исследовании воздуха

Чаши с агаром эндо помещают в термостат при 37оС на 18-20 ч, а чашки с висмут-сульфит агаром инкубируют при той же температуре 48 час.

Колонии подозрительные на сальмонеллы идентифицируют по той же схеме, что и изолированные из других объектов.

11. Идентификация сальмонелл

После 18-20 часового инкубирования чашек с дифференциально-диагностическими средами (висмут-сульфит агар 48 час.) производится учет характера роста с отбором 3-5 подозрительных колоний на одну из сред для первичной идентификации (Клиглера, Ресселя, Олькеницкого) и на скошенный питательный агар. В случае чрезвычайной эпидемической ситуации культуру, выросшую на указанных средах, используют для последующей постановки реакции агглютинации. Результаты этой реакции ориентировочны и требуют подтверждения на этапе завершения биохимической идентификации.

11.1. Определение ферментативных свойств выделенных микроорганизмов


Если культуры не ферментируют лактозу, не расщепляют мочевину, но фермен­тируют глюкозу и образуют сероводород, то они подозрительны на принадлежность к роду сальмонелла и подвергаются дальнейшему изучению.

О ферментации лактозы (и сахарозы) в среде Олькеницкого и ферментации лактозы в среде Клиглера и Ресселя судят по появлению желтой окраски в скошенной части агара, а о ферментации глюкозы - по такому же окрашиванию в столбике. Газообразование устанавливают по наличию пузырьков газа и разрыву агара, а образование сероводорода - по почернению среды. В среде Олькеницкого при росте культуры, гидролизирующей мочевину, среда приобретет диффузный яркий красно-малиновый цвет.

В случае если в результате прямого посева испражнений не выросло ни одной колонии или выросли единичные колонии, необходимо произвести повторный высев, увеличив порцию засеваемого материала. При повторном отсутствии роста следует получить материал для исследо­вания еще раз.

У подозрительных культур изучают их ферментативные характеристики, позво­ляющие определить родовую принадлежность выделенных бактерий. Для этих целей используют тесты, позволяющие определить способность к образованию индола, наличие роста на средах с цитратами, разложение салицина и малоната натрия, наличие лизин-декарбоксилазы, фенилаланиндезаминазы, способность к разложению мочевины, образованию ацетил-метил-карбинола в реакции Фогес-Проскауэра. Ставится также проба с метиловым красным и определяется подвижность.

Сальмонеллы индола не образуют, способны расти на средах с цитратами, декарбоксилировать лизин (за исключением некоторых штаммов S.Typhimurium, S.Enteritidis), не имеют фенилаланиндезаминазы, не разлагают мочевину, отрицательны в реакции Фогес-Проскауэра, положительны в пробе с метил-рот, под­вижны (за исключением S.Gallinarum). Подавляющее большинство сальмонелл не ферментируют салицин.

Для определения родовой принадлежности культур можно использовать систе­мы для идентификации энтеробактерий, в т.ч. пластины биохимические, дифферен­цирующие энтеробактерий (ПБДЭ), Аpi20Е, Бак трак, Vidas, mini-Vidas и другие приборы, прошедшие соответствую­щие испытания и рекомендованные к применению в лабораториях системы Роспотребнадзора РФ.

При необходимости получения срочного, предварительного ответа, определяет­ся антигенная структура выделенных возбудителей в реакции агглютинации на стекле с О и Н-агглютинирующими диагностическими сальмонеллезными сыворотками.

Серотипирование штаммов сальмонелл включает в себя выявление соматического антигена (О-антигены сальмонелл), являющегося липополисахаридом (ЛПС), и жгутиковых антигенов (Н-антигены), представленных термолабильными белками. Большинство сероваров сальмонелл имеют Н-антигены двух фаз. Такие сальмонеллы называются двуфазными (например - S.Typhimurium. Антигенная формула - О: 1, 4, 5, 12; H:i; 1.2). Известны монофазные (например - S.Enteritidis, антигенная формула - О:1, 9, 12; Н: gm). Неподвижные (бесфазные) – S. Gallinarum.

Определение сероваров основано на антигенной комбинации отдельных О- и Н- антигенов.

11.2.Определение О-антигенов, выделенных микроорганизмов


Определение О-антигена проводится в реакции агглютинации на стекле. В сыворотке находятся антитела к О-антигенам сальмонелл, которые образуют агглютинат с бактериями, обладающими соответствующими антигенами.

Растворять сухие сальмонеллезные О-сыворотки следует в 1,0 мл изотонического раствора хлорида натрия (или 2,0 мл), согласно прилагаемой инструкции.

На предметное стекло наносится одна капля сыворотки и одна капля изотонического раствора хлорида натрия. С питательного агара берется полная петля культуры, выращенной в течение 18-24 часов при 37оС. Культура наносится на предметное стекло вблизи капли изотонического раствора хлорида натрия и эмульгируется (контроль на отсутствие спонтанной агглютинации). При отсутствии спонтанной агглютинации манипуляцию повторяют в капле О сыворотки, формируя равномерную непрозрачную суспензию. Учет результатов проводят в течение 1-2 минут, мягко покачивая стекло. Гомогенная суспензия свидетельствует об отрицательном результате. Образование хлопьев агглютината внутри капли расценивается как положительный результат.

Агглютинация проявляется через несколько секунд (или 1 минуты) в виде хлопьев (зерен) агглютината формирующихся внутри капли на фоне ее просветления. Штаммы, находящиеся в R-форме, обладают самопроизвольной агглютинацией. Их дальнейшее серотипирование не представляется возможным без дополнительных манипуляций. Такие штаммы пересевают на слабощелочной агар для того, чтобы выбрать колонию с ровными краями и вернуть штамм в S (гладкую) форму и повторить агглютинацию. Если агглютинация с поливалентными О-антисыворотками не происходит, маловероятно, что штамм относится к роду Salmonella.

11.3. Определение Н-антигена выделенных микроорганизмов

Для определения Н-антигенов используют ту же культуру, выросшую на питательном агаре. Если культура малоподвижна, можно применять полужидкий (0,7%) агар, условно называемый агаром для роения, формируя посев в виде небольшого пятна в центре чашки Петри. Посев инкубируют в течение ночи при 37оС. Сухие сальмонеллезные Н-сыворотки растворяются также как и О-сыворотки, согласно прилагаемой инструкции. На предметное стекло наносят одну каплю Н-сыворотки и одну каплю изотонического раствора хлорида натрия. С периферии указанного агара для роения или из конденсата на косяке берут полную петлю культуры. Наносят ее на предметное стекло вблизи капли изотонического раствора хлорида натрия и эмульгируют (контроль на отсутствие спонтанной агглютинации). При отсутствии спонтанной агглютинации манипуляцию повторить в капле Н - сыворотки, формируя равномерную непрозрачную суспензию. Учет результатов проводят в течение 1-2 минут, мягко покачивая стекло. Гомогенная суспензия свидетельствует об отрицательном результате. Образование хлопьев (зерен) агглютината внутри капли расценивается как положительный результат.

Результаты определения О- и Н - антигенов сальмонелл фиксируются в протоколе. В случае отсутствия реакции агглютинации с сыворотками одной из Н-фаз проводят инверсию (подавление) обнаруженной Н-фазы (метод Свена-Гарда).

Для определения невыявленного Н-антигена готовят чашки Петри с полужидким (0,7%) агаром. После застывания агара в центр чашки добавляют 0,1 мл антисыворотки против выявленного Н-антигена первой или второй фазы. Дают сыворотке впитаться в агар, а затем в центр капли петлей наносят культуру.

Вместо чашки можно также использовать U-образную трубку. Инкубировать посев при 37°С 18-24 часа (чашки не переворачивать!). Соответствующая антисыворотка связывает выявленный Н-антиген, подвижность (роение) штамма будет происходить за счет клеток, содержащих Н-антиген не обнаруживаемой фазы. Неизвестная фаза Н-антигена определяется тем же способом, что и выявленная. При этом культура берется с периферии выросшей макроколонии или с противоположного относительно посеву колена U-образной трубки. Затем после суммирования результатов О и Н – серотипирования определяется серовар штамма, согласно схемы Кауфмана-Уайта.

Серологическую идентификацию сальмонелл начинают с испытания их в реакции агглютинации на стекле с агглютинирующей адсорбированной поливалентной сывороткой к сальмонеллам групп А, В, С, Д, Е), а в случае полу­чения отрицательного результата с агглютинирующей адсорбированной поливалентной сывороткой к сальмонеллам редких групп.

При получении положительных результатов агглютинации со смесью О-сывороток, культуру испытывают с каждой О-сывороткой, входящей в смесь. После установления принадлежности культуры к одной из О-групп, выявляют наличие до­полнительных О-антигенов, присущих представителям указанной группы.

После этого проводят реакцию агглютинации с Н-сыворотками. При этом вна­чале используют Н-сыворотки, соответствующие Н-антигенам 1 фазы, а потом Н-антигенам 2 фазы. Начинать следует с Н-сывороток, соответствующих более распро­страненным сероварам данной группы.

Для реакции агглютинации с О-сывороткой следует брать культуру с верхней части скошенного агара, для Н-сывороток - конденсат или с нижнего участка роста (наиболее подвижные особи).

Для подтверждения принадлежности культуры к роду Salmonella, в случае за­труднений с идентификацией, можно пользоваться пробой с бактериофагом, используя лечебный бактериофаг сальмонеллезный.

Для этого две капли четырех или восемнадцати часовой бульонной культуры испытуемого штамма наносят тонко оттянутой пастеровской пипеткой или петлей на хорошо подсушенный слабощелочной агар в чашке Петри. После подсыхания на одну из капель петлей или пастеровской пипеткой меньшего диаметра, наносят каплю бактерио­фага, а на другую, в качестве контроля - каплю бульона.

На одной чашке, таким образом, можно испытать одновременно 5-6 культур.

Чашки с нанесенными культурами и бактериофагом помещают в термостат на 18-24 часа, после чего учитывают результаты по появившейся на месте нанесения фага четко очерченной зоне сливного лизиса или большего или меньшего числа нега­тивных колоний.

При отсутствии лизиса в местах нанесения фага будет сплошной рост культуры, как в контроле.

Атипичные сальмонеллезные культуры в большинстве случаев чувствительны к фагу, в то время как штаммы представителей других родов семейства Enterobacteriaceae как правило не лизируются этим фагом.

11.4.Определение биоваров сальмонелл

В пределах некоторых сероваров сальмонелл наблюдается различная ферментативная активность в отношении отдельных углеводов, органических кислот или многоатомных спиртов. Это позволяет проводить биохимическое типирование штаммов сальмонелл, относящихся к таким сероварам.

Типирование можно осуществлять по любой комбинации тестов, по отношению к которым выявлены вариабельные свойства у штаммов одного серовара.

Наибольшее число биоваров сальмонелл выявлено среди штаммов S. Typhimurium (табл.2).

В настоящее время типирование среди S.Enteritidis проводят по способности к ферментации бульона Штерна и наличию лизиндекарбоксилазы. S.Enteritidis var. ratin характеризуется отсутствием указанных ферментов, a S.Enteritidis var jena - их наличием.

По способности ферментировать d-тартрат различают S.Java (d-тартрат положительна) и S.Paratyphi В (d-тартрат отрицательна).

Табл. 2

Биовары S.Typhimurium

Биовар

Арабиноза

Ксилоза

Рамноза

d-тартрат

i-тартрат

Мукат

Инозит

1-й

+













2-й

+

+











3-й

+

+

+









4-й

+

+

+

+







5-й

+

+

+

+

+





6-й

+

+

+

+

+

+



7-й

+

+

+

+

+

+

+

8-й

+



+

+

+

+

+

9-й

+

+



+

+

+

+

10-й

+

+



+

+



+

11-й



+

+





+

+

12-й

+

+



+

+

+



13-й







+

+

+

+

14-й





+

+

+

+

+

15-й

+



+

+

+

+



16-й

+



+





+

+

17-й

+

+

+





+



18-й

+

+

+





+

+

19-й

+

+

+







+

20-й

+

+

+



+





21-й

+

+

+

+



+

+

22-й

+

+

+



+

+



23-й

+

+

+



+

+

+

24-й

+

+

+

+



+



25-й

+

+

+

+

+



+


Необходимо учитывать, что в последнем издании съемы Кауфмана-Уайта (2001 г.) выделяемые ранее как серовары сальмонелл, имеющие одну и ту же антигенную структуру и отличающиеся только по некоторым биохимическим характеристикам объединены в один серовар (S.Isangi объединена с S.Mission, S.Gallinarum с S.Pullorum, S.Paratyphi B с S.Java). Кроме этого, О-группа Е1 объединена с О-группой Е2 и Е3.
1   2   3   4   5

Похожие:

Методические указания Методические указания разработаны фгун «цнии эпидемиологии» iconВременные методические указания к изучению санитарных
Настоящие Методические указания разработаны в соответствии с планом гкнт по проблеме
Методические указания Методические указания разработаны фгун «цнии эпидемиологии» iconМетодические указания по дисциплине «физические основы оптической связи»
Методические указания разработаны кандидатом физико-математических наук, доцентом Нойкиным Ю. М
Методические указания Методические указания разработаны фгун «цнии эпидемиологии» iconМетодические указания к спецкурсу «Основы психолингвистики»
Методические указания разработаны кандидатом филологических наук, доцентом кафедры русского языка Ф. Г. Самигулиной
Методические указания Методические указания разработаны фгун «цнии эпидемиологии» iconМетодические указания по курсу «Ландшафты мира и проблемы природопользования» (часть 1) по специальности 013600 Геоэкология
...
Методические указания Методические указания разработаны фгун «цнии эпидемиологии» iconМетодические указания по чтению текстов на испанском языке о древних культурах центральной и южной Америки для студентов философов и культурологов
Методические указания разработаны преп кафедры французского и испанского языков Родригес А. Э
Методические указания Методические указания разработаны фгун «цнии эпидемиологии» iconУтверждены Минздравом СССР лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных, обнаружение сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды (методические указания)
Методические указания разработаны: Всесоюзным центром по сальмонеллам Центрального
Методические указания Методические указания разработаны фгун «цнии эпидемиологии» iconМетодические указания по оценке подлинности и выявлению фальсификации молочной продукции
«Методические указания по оценке подлинности и выявлению фальсификации молочной продукции». Методические указания. – М.: Федеральный...
Методические указания Методические указания разработаны фгун «цнии эпидемиологии» iconМетодические указания му 5 705-98 "Борьба с комарами, выплаживающимися в подвальных помещениях"
Методические указания разработаны для внедрения и применения Санитарных правил и норм СанПиН 5 541-96 "Требования к организации и...
Методические указания Методические указания разработаны фгун «цнии эпидемиологии» iconМетодические указания разработаны на кафедре «Иностранные языки»
Английский язык. Грамматика. Сборник упражнений : методические указания для изучения грамматических основ английского языка для студентов...
Методические указания Методические указания разработаны фгун «цнии эпидемиологии» iconМетодические указания му 1 2438-09 Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Ю. В. Демина), фгун «Санкт-Петербургский нии эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Разместите кнопку на своём сайте:
Библиотека


База данных защищена авторским правом ©tnu.podelise.ru 2013
обратиться к администрации
Библиотека
Главная страница